Laccases and other ligninolytic enzymes of the basidiomycetes Coprinopsis cinerea and Pleurotus ostreatus

- submerged and solid state fermentation, morphological studies of liquid cultures and characterisation of new laccases

Author: Rühl, Martin Universität Göttingen, 18. January 2010 pages: 298 edition: 1 Aufl. language: EN ISBN-10: 3869552395 ISBN-13: 9783869552392 allocated areas: Biologie | Biochemie category: Dissertation source of supply Print Version 40,00 € 38 in the shopping basket eBook (3025.9 kB) 40 in the shopping basket

Kurzbeschreibung

In einer vergleichenden Studie zwischen Schüttelkolben und Bioreaktor wurden Morphologie
und Laccaseausbeute eines mit dem Plasmid pYSK7 transformierten Stammes des
Basidiomyceten Coprinopsis cinerea untersucht. Das verwendete Plasmid beinhaltet das
C. cinerea Laccase Gen lcc1, das in seiner Expression durch den Agaricus bisporus gpdII
Promotor kontrolliert wird. Der C. cinerea Transformant wuchs in beiden Kultivierungsformen
in Form von Pellets, wobei die Pellets in den Schüttelkulturen bei 120 upm (Umdrehung pro
Minute) gleichmäßiger und kleiner waren als jene, die sich im Bioreaktor bei einer
Rührgeschwindigkeit von 120 upm ausbildeten. Im Rührkesselreaktor, in dem der pH Wert
konstant bei pH 6, pH 7 oder pH 8 gehalten wurde, konnte man eine höhere Fragmentierung
der Pellets bei den höheren pH Werten pH 7 und pH 8 feststellen. Bei pH 6 zeigten die
Pellets allerdings eine gleichmäßigere Größe. Außerdem wurden die höchsten
Laccaseaktivitäten in den Bioreaktorkulturen bei pH 6 gemessen. In den Schüttelkulturen, die
bei 25 °C und 37 °C inkubiert wurden, konnten Laccaseaktivitäten von bis zu 10 U/ml bei der
niedrigeren Kultivierungstemperatur von 25 °C erreicht werden. Mikrotomschnitte von in
Wachs eingebetteten Pellets zeigten, dass Pellets aus den Schüttelkulturen bei 25 °C aussen
vergleichsweise glatt waren. Ein dichter Ring von kompaktem Myzel umgibt einen weniger
dichten inneren Bereich. Im Gegensatz dazu waren Pellets bei 37 °C vom Erscheinungsbild
her eher aufgerauht und der äußere Myzelring war breiter und nicht so dicht gepackt wie bei
Pellets bei 25 °C.
Um die natürliche Laccaseproduktion von C. cinerea zu testen, wurden zehn unterschiedliche
Monokaryonten bei jeweils 25 °C und 37 °C in zwei unterschiedlichen Medien kultiviert.
Insgesamt waren bei neun der Stämme die Laccaseausbeuten bei 25 °C höher als bei 37 °C,
wobei ein Stamm (LN118) keine oder nur sehr geringe Mengen an Laccase produzierte. In
sieben der Stämme wurden Laccaseaktivitäten von 1 U/ml und mehr erreicht, wenn diese in
Glukose-haltigem Medium bei 25 °C kultiviert wurden. Anhand einer LC-MS/MS Analyse
konnte gezeigt werden, dass die Laccaseaktivität dieser sieben Stämme aus zwei oder
mehreren verschiedenen Isoenzymen und/oder Isoformen resultiert. Fünf verschiedene
Isoenzyme (Lcc1, Lcc2, Lcc5, Lcc9 und Lcc10) die in verschiedenen Zusammensetzungen in
den einzelnen Stämmen vorkommen, konnten nachgewiesen werden. Lcc1 und Lcc5 wurden
von allen Stämmen in hohen Mengen produziert.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die rekombinante Produktion eines einzelnen
Isoenzyms in C. cinerea zu erhöhen. Versuche zur Optimierung der
Kultivierungsbedingungen mit verschiedenen C. cinerea Kulturmedien ergaben, dass das
Glukose-basierte Medium (modified Kjalke) die höchsten Laccaseausbeuten lieferte. Durch
verschiedene Optimierungsversuche konnte für einen Lcc1 Transformanten des C. cinerea
Stammes FA2222 die Laccaseaktivität im Kulturüberstand insgesamt von ungefähr 3 U/ml
auf über 10 U/ml erhöht werden. Laccase Erträge von bis zu 11 U/ml wurden auch für den
Lcc1 Transformanten des C. cinerea Stammes LN118 erzielt.
Neben der Laccase Lcc1 wurden auch die Laccasen Lcc5, Lcc6 und Lcc7 rekombinant in
C. cinerea FA2222 bei 37 °C produziert. Die Laccasen wurden aus dem Kulturüberstand der
Schüttelkolben aufgereinigt. Ihre optimale Reaktionstemperatur, ihr optimaler pH Wert und
ihre kinetischen Parameter wurden für vier verschiedene Laccasesubstrate analysiert.
Stabilitätstests bezüglich Temperatur, pH und organischen Lösungsmitteln zeigten, dass Lcc5
insbesondere für Reaktionen bei hohen Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln
geeignet ist. Zusätzlich wurde die 3-dimensionale Struktur von Lcc5 mit Hilfe der
Röntgenstrukturanalyse bestimmt.