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Biomarker lebensmittel- und umweltrelevanter Xenobiotika
Analytik von Glutathionkonjugaten und Mercaptursäuren
Kurzbeschreibung
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) repräsentieren eine Klasse von Xenobiotika, die – neben anderen Quellen – in unterschiedlichen Arten von Lebensmitteln auftreten. Nach der Nahrungsaufnahme werden die PAK bereits beim Passieren des Gastrointestinaltraktes durch Phase-I- und Phase-II-Enzyme metabolisiert. Die hierbei gebildeten Metaboliten unterliegen anschließend einem Transport durch die in den Epithelzellen entlang des Verdauungstraktes lokalisierten Proteine der ATP-binding cassette-Familie. PAK können über ihre jeweiligen Dihydrodiole zu den biologisch aktiven Dihydrodiolepoxiden umgesetzt werden, welche über die Fähigkeit verfügen, genotoxische DNA-Addukte zu bilden. Es besteht jedoch die Möglichkeit der Detoxifizierung der Dihydrodiolepoxide durch Konjugationsreaktionen mit Glutathion (GSH) sowie einer nachfolgenden Exkretion der gebildeten Konjugate aus der Zelle.
Mit dem Ziel der Bestimmung von GSH-Konjugaten der kanzerogenen PAK Benzo[a]pyren (B[a]P), Dibenzo[a,l]pyren (DB[a,l]P) und Benzo[c]phenanthren (B[c]Phe) wurden spezifische LC-ESI-MS/MS-Methoden entwickelt. Medium- und Zellextraktproben von Caco-2-Zellkulturen, die mit den Dihydrodiolen oder Dihydrodiolepoxiden eines jeweiligen PAK zuvor inkubiert worden waren, unterlagen zunächst einem Aufreinigungsschritt mittels Festphasenextraktion (SPE). Für die Quantifizierung der GSH-Konjugate erwies sich die LC MS/MS-Technik im Selected Reaction Monitoring (SRM)-Modus aufgrund der guten Sensitivität und Selektivität als am besten geeignet. Während dieses Prozesses erfolgte eine Fragmentierungsreaktion des jeweiligen Molekül-Ions zu seinem korrespondierenden Daughter-Ion. Zusätzliche massenspektrometrische Scan-Modi, wie der Daughter Scan (DAU)-Modus, fanden im Rahmen von Strukturaufklärungen Anwendung.
Die Detoxifizierung mittels GSH-Konjugation konnte im Caco-2-Zellmodell für die Substanzklasse der PAK anhand ihrer Vertreter B[a]P, DB[a,l]P und B[c]Phe mit der entwickelten Analytik erfolgreich untersucht werden. Hierbei lag der Fokus auf der Entgiftung der ultimal kanzerogenen Dihydrodiolepoxide (+)-anti-BPDE, (-)-anti-DBPDE sowie (-)-anti-BcPheDE. Dieser Prozess beinhaltete sowohl die Bildung der GSH-Konjugate als auch deren Transport aus der Caco-2-Zelle in das umgebende Medium, der im TranswellTM-System überwiegend in basolateraler Richtung erfolgte und daher einer Exkretion in Richtung Blutkreislauf gleichzusetzen war. Das entwickelte analytische Verfahren erlaubte folglich die Durchführung von Transportexperimenten in Zellkultur, ohne dass isotopenmarkierte Substanzen eingesetzt werden mussten.
Durch Vorbehandlung des Zellsystems mit spezifischen Hemmstoffen konnten die Multidrug Resistance-associated Proteins und nicht das Breast Cancer Resistance Protein als verantwortliche Transporter von GSH-Konjugaten identifiziert werden. Einflüsse ausgewählter Substanzen mit chemopräventivem Potential, wie Oltipraz, Quercetin und Butyrat, bewirkten überdies detoxifizierungs-fördernde Effekte durch Induktion der GSH-Konjugat-Transportrate. Des Weiteren gaben Inkubationen von Caco-2-Zellen mit den Mutterkohlenwasserstoffen B[a]P, DB[a,l]P und B[c]Phe Aufschluss über die metabolische Kompetenz der Zellen und das jeweilige Gesamtmetabolitenprofil.
Typische niedermolekulare aromatische Kohlenwasserstoffe mit nur einem Ringsystem sind Benzol und Toluol, die auch zu den volatile organic compounds (VOC) gezählt werden. Die genannten VOC können über Lebensmittel aufgenommen werden, wobei die Produkte durch eine externe Kontamination belastet sein können. Im Falle des Benzols wird auch eine mögliche Bildung aus dem Konservierungsstoff Benzoesäure diskutiert. Darüber hinaus sind ebenfalls inhalative Belastungen durch Abgase sowie speziell bei Rauchern der Zigarettenrauch als Hauptaufnahmequelle für Benzol anzuführen. Nach Inhalation, dermaler oder oraler Exposition werden Benzol und Toluol im menschlichen Körper zu ihren korrespondierenden Mercaptursäuren verstoffwechselt, die neben anderen Metaboliten mit dem Urin ausgeschieden werden. Dieser Detoxifizierungsprozess kann für analytische Untersuchungen im Sinne der Bestimmung von Belastungsmarkern herangezogen werden und stellt gleichzeitig eine nicht-invasive Technik dar. Dem Clean-Up der Urinproben mittels SPE wurde eine Schwefelsäurebehandlung der Urine vorgeschaltet, um eine quantitative Umwandlung von prä-Mercaptursäuren in Mercaptursäuren zu erreichen. Mit dieser entwickelten Methode ließ sich folglich der Gesamtgehalt an S-Phenylmercaptursäure (S PMA) ermitteln. Zur Bestimmung der als Biomarker fungierenden Mercaptursäuren diente die LC-MS/MS-Technik, wobei aufgrund der hohen Empfindlichkeit ebenfalls der SRM-Modus zum Einsatz gelangte. Die im Vergleich zu Nichtrauchern in Raucher-Urinen gefundenen höheren S-PMA-Gehalte verdeutlichen einen stärkeren Belastungsgrad der Raucher mit Benzol. Demgegenüber ließen sich in Raucher- und Nichtraucher-Urinen vergleichbare Konzentrationen der S-Benzylmercaptursäure nachweisen, was möglicherweise auf eine ähnliche Belastung mit Toluol schließen lässt. Die S-Naphthylmercaptursäure als Biomarker des PAKs Naphthalin konnte im Zuge der Untersuchungen nicht detektiert werden.
Die entwickelte Methode wurde darüber hinaus zu einer qualitativen Analyse weiterer Mercaptursäuren lebensmittelrelevanter Fremdstoffe herangezogen. Die zusätzlich zum massenspektrometrischen SRM-Modus eingesetzten DAU- und Constant Neutral Loss (CNL)-Modi detektierten hierbei die charakteristischen Masse/Ladungs-Verhältnisse der Mercaptursäuren von Glycidamid, Glycidol und Acrolein. Dabei zeigte sich aufgrund gruppenspezifischer Fragmente eine mögliche Anwendbarkeit der Methode auch für unbekannte Mercaptursäuren.
Zusammenfassend kann man feststellen, dass die in der vorliegenden Arbeit entwickelten analytischen Methoden eine selektive und sensitive Bestimmung von sowohl GSH-Konjugaten als auch Mercaptursäuren unter in-vitro- und in-vivo-Bedingungen mittels LC MS/MS erlauben, welche als Biomarker einer Entgiftung intermediärer reaktiver Metaboliten von kanzerogenen Fremdstoffen große Aufmerksamkeit verdienen.
Description
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) represent a class of xenobiotics occurring, among other sources, in different types of food. After food consumption PAH are metabolised as early as passing the human gastrointestinal tract by a number of phase I and II enzymes. The metabolites formed are handled by several transport proteins of the ATP-binding cassette (ABC) superfamily present in epithelial cells lining the alimentary tract. PAH can be metabolised via their specific dihydrodiols to the biologically active dihydrodiol epoxides which can form genotoxic DNA adducts. On the other hand, dihydrodiol epoxides can be detoxified by conjugation with glutathione (GSH) and subsequent transport of the resulting conjugates out of the cell.
For the determination of GSH-conjugates of the carcinogenic PAH benzo[a]pyrene (B[a]P), dibenzo[a,l]pyrene (DB[a,l]P) and benzo[c]phenanthrene (B[c]Phe) specific LC-ESI-MS/MS-methods were established. Medium- and cell extract samples from Caco-2 cell cultures incubated with dihydrodiols or dihydrodiol epoxides of a particular PAH were cleaned up by a solid phase extraction (SPE) step. LC-MS/MS analysis operated in the selected reaction monitoring mode (SRM) appeared to have the best specificity and sensitivity for the analysis of these GSH-conjugates whose molecular-ions are fragmented during this process to their associated daughter-ions. Additional mass spectrometric scan modes like the daughter scan mode were used for structure determinations.
Detoxification by GSH-conjugation could be successfully analysed for the class of PAH by means of its representatives B[a]P, DB[a,l]P and B[c]Phe in the Caco-2 cell system with the described method. In this connection the focus was based on the detoxification of the ultimate carcinogens (+)-anti-BPDE, (-)-anti-DBPDE and (-)-anti-BcPheDE. This process included the formation of the GSH-conjugates as well as their transportation from the Caco-2 cells into the surrounding medium which occurred in the transwellTM-system overall to the basolateral side signifying an excretion into the blood circulation. Accordingly, this method enables the procedure of transport experiments in cell culture with non-labeled compounds.
Pre-treatments of the cell system with specific inhibitors could identify the multidrug resistance-associated proteins and not the breast cancer resistance protein as responsible transporters for the GSH-conjugates. Influences of selected substances possessing a chemopreventive potential, like oltipraz, quercetin and butyrate, caused supporting detoxification effects by inducing the GSH-conjugate transport rate. Furthermore, incubations of Caco-2 cells with the parent compounds B[a]P, DB[a,l]P and B[c]Phe gave information about the metabolic competence of the cells and the respective metabolic pattern.
Typical low-molecular aromatic hydrocarbons with only one ring system are benzene and toluene, which belong to the volatile organic compounds (VOC). The mentioned VOC can be taken in via food, whose contamination can be caused by external sources. In case of benzene, a probable formation out of the preservative benzoic acid is under discussion. Beyond that, there are inhalative contaminations caused by exhaust fumes and especially for smokers the cigarette smoke as main intake source for benzene. After inhalation, dermal or oral exposition, VOC like benzene and toluene are transformed during metabolism in the human body to their corresponding mercapturic acids which are excreted besides other metabolites by urine. This detoxification process can be used for analysis concerning markers of exposure and it represents simultaneously a non-invasive technique. Prior to sample clean-up by SPE, the urine samples were treated with sulfuric acid in order to achieve a quantitative transformation of pre-mercapturic acids into their respective mercapturic acids. By means of the developed method, the total S-phenylmercapturic acid (S-PMA) concentration could be revealed. For determination purposes of these mercapturic acid biomarkers served the LC-MS/MS technique and due to its high sensitivity the SRM-mode was applied.
In comparison to non-smokers, the smokers urine showed higher amounts of S-PMA and therewith higher levels of exposure to benzene. In contrast, similar concentrations of S benzylmercapturic acid could be revealed in smokers and non-smokers urine, what is probably provoked by an equal exposure to toluene. S-naphthylmercapturic acid as biomarker of the PAH naphthalene could not be detected in the course of the examinations.
Moreover, the developed method was applied for a qualitative analysis of further food-relevant mercapturic acids. Besides the mass spectrometric SRM-mode the adopted DAU- and constant neutral loss (CNL)-modes detected the characteristic m/z-ratios belonging to the mercapturic acids of glycidamide, glycidol and acrolein. Thereby, the adaptability of this method, also for unknown mercapturic acids, was shown due to group-specific fragments.
In summary, one can conclude, that the analytical methods developed in this work allow selective and sensitive determinations of both GSH-conjugates and mercapturic acids under in vitro and in vivo conditions with LC-MS/MS. These biomarkers resulting from detoxifications of intermediate reactive metabolites of carcinogenic xenobiotics deserve great attention.
Stichwörter
polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, flüchtige organische Verbindungen, Glutathionkonjugate, Mercaptursäuren, LC-MS/MS, Caco-2-Zellen, ABC-Transporter
Keywords
polycyclic aromatic hydrocarbons, volatile organic compounds, glutathione conjugates, mercapturic acids, LC-MS/MS, Caco-2 cells, ABC-transporters
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