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Funktionelle Charakterisierung von Enzymen des Sekundärstoffwechsels in Lavendel (Lavandula angustifolia) und Erdbeere (Fragaria x ananassa)
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Autor(en):
München, 01. November 2007
Seiten: 176
Auflage: 1
Sprache: DE
ISBN-10: 386727407X
ISBN-13: 9783867274074
Zugeordnete Fachbereiche:
Chemie | Biochemie
Kategorie:
Dissertation
Bezugsmöglichkeiten
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Kurzbeschreibung
Pflanzen synthetisieren eine immense Zahl von sekundären Inhaltsstoffen wie Terpene, Alkaloide und phenolische Substanzen. Die Biosynthese dieser Verbindungen wird von entsprechend vielen verschiedenen Enzymen gewährleistet. Drei Enzymgruppen, deren Reaktionen eine große Rolle im Sekundärstoffwechsel spielen, sind in dieser Arbeit betrachtet worden: Glucosyltransferasen, Terpensynthasen und Acyltransferasen.
Kürzlich wurde eine UDP-Glucose:Cinnamat-Glucosyltransferase der Kulturerdbeere (Fragaria x ananassa) (FaGT2) beschrieben, die die Bildung von Zimtsäure- und p-Cumarsäure-Glucoseester während der Fruchtreifung katalysiert. Dieses Enzym, das in der Erdbeerfrucht reife- und stressinduziert exprimiert wird, setzt jedoch auch weitere, strukturell verschiedene Substrate natürlichen und anthropogenen Ursprungs in vitro um. Deren Reaktionskinetiken wurden verglichen, um zusätzliche biologische Funktionen des Enzyms aufzuklären. Das Spektrum der akzeptierten Substrate reichte von Zimtsäure- und Benzoesäurederivaten über heterozyklische und aliphatische Strukturen und resultierte in der Bildung von O- und S-Glucoseestern sowie O-Glucosiden. Die Synthese der glucosidischen Verbindungen wurde in planta bestätigt, nachdem die Substrate in reife Erdbeeren injiziert worden waren. Als gemeinsame chemische und strukturelle Eigenschaften, die für die enzymatische Aktivität erforderlich sind, wurden die einfache Deprotonierung der Glucosylierungsstelle und die Konjugation der dabei gebildeten Anionen mit S-Elektronen identifiziert. Sorbinsäure repräsentiert das Substrat mit der einfachsten Struktur, das mit sehr hoher Effizienz umgesetzt wurde. Als natürliche Substrate wurden neben Zimtsäure auch Anthranilsäure, (E)-2-Hexensäure, Nicotinsäure und 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3[2H]-furanon glucosyliert. Die glucosidischen Produkte dienen möglicherweise als Vorläufersubstanzen von wichtigen Aromastoffen oder als Speicherungsformen. FaGT2 setzte aber höchst effizient auch Xenobiotika um wie das Herbizid 2,4,5-Trichlorphenol oder die zu einem Herbizidmetaboliten analoge 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzoesäure. Diese Ergebnisse in Verbindung mit der stressinduzierten Expression von FaGT2 legen nahe, dass das Enzym in die Detoxifizierung von Xenobiotika involviert ist.
In den Früchten der kultivierten Erdbeere (Fragaria x ananassa) trägt der Monoterpenalkohol Linalool, der überwiegend als (S)-Enantiomer vorliegt, zum Aroma bei. Die Biosynthese des (S)-Linalools in Erdbeerfrüchten wurde kürzlich aufgeklärt und wird von der Terpensynthase FaNES1 katalysiert. In den Blättern von Fragaria x ananassa und vor allem in denen der wilden Erdbeere (Fragaria vesca) liegt neben (S)-Linalool ein höherer Anteil (R)-Linalool vor. Durch eine Polymerase-Kettenreaktion-Strategie (PCR-Strategie), die die Homologie von Terpensynthase-genen ausnutzt, wurden aus komplementärer DNA (cDNA) von Blättern der Arten Fragaria vesca und Fragaria x ananassa zwei Teilsequenzen extrahiert, die sehr hohe Identitäten mit FaNES1 aufweisen. Aus Fragaria x ananassa wurde FaLINS in Volllänge kloniert, das codierte Protein in Escherichia coli exprimiert und mit dem Substrat Geranyldiphosphat (GPP) umgesetzt. Mittels multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie wurde nachgewiesen, dass FaLINS trotz einiger Sequenzunterschiede zu FaNES1 ebenfalls ausschließlich (S)-Linalool bildet. Offenbar handelt es sich bei den beiden Sequenzen um unterschiedliche Allele oder paraloge Gene, die in Blättern und Früchten differenziert exprimiert werden. In Fragaria vesca wurde bereits eine Linaloolsynthase (FvNES) mit unbekannter Stereospezifität nachgewiesen, die ebenfalls homolog zu FaNES1 ist, jedoch ein zusätzliches N-terminales Sequenzelement enthält. Dieses Enzym wurde wie FaLINS heterolog exprimiert und in einem Enzymassay untersucht. Da es ausschließlich (S)-Linalool bildet, kann ausgeschlossen werden, dass der N-terminale Sequenzabschnitt die Stereospezifität der enzymatischen Reaktion beeinflusst.
Das wirtschaftlich bedeutsame etherische Öl des Echten Lavendels (Lavandula angustifolia) enthält eine große Zahl an Mono- und Sesquiterpenen. Ähnlich wie in der Erdbeere wurden durch eine Homologie-basierende Strategie die drei neuen Terpensynthasen LaLIMS, LaLINS und LaBERS kloniert. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass deren Sequenzen den Terpensynthasen aus anderen Vertretern der Familie Lamiaceae ähneln. Die Enzyme wurden heterolog in Escherichia coli exprimiert und biochemisch hinsichtlich optimaler Reaktions-bedingungen (pH-Wert, Temperatur und Cofaktorkonzentrationen) und kinetischer Parameter charakterisiert.
LaLIMS bildet die sechs Monoterpene Limonen (39 %), Terpinolen (22 %), Camphen (16 %), D-Pinen (14 %), E-Myrcen (8 %) und D-Phellandren (1 %). Die Analyse mittels Chiralphasen-Gaschromatographie zeigte, dass in großem Überschuss die Enantiomere (1R,5R)-(+)-D-Pinen, (1R,4S)-(+)-Camphen und (R)-(+)-Limonen synthetisiert werden. Die Assays ließen zudem eine unterschiedliche Produkt-zusammensetzung bei Verwendung von Mangan-und Magnesiumkationen erkennen, was den Einfluss dieser Cofaktoren auf die Struktur und Reaktion der Terpensynthasen unterstreicht. Multiproduktsynthasen wie LaLIMS erklären, wie die vielen unterschiedlichen Terpene im etherischen Öl entstehen, ohne dass eine entsprechend große Zahl an Enzymen vorhanden sein muss. LaLINS katalysiert die Transformation von GPP zu ausschließlich (R)-Linalool. Die stark bevorzugte Bildung des (R)-Enantiomers korrespondiert mit der Konfiguration der Hauptinhaltsstoffe des Lavendelöls, (R)-Linalool und (R)-Linalylacetat. Daher dürfte das Enzym von entscheidender Bedeutung für das Aromaprofil von Lavandula angustifolia sein. Das dritte Enzym, LaBERS, ist eine Sesquiterpensynthase und bildet aus Farnesyldiphosphat (FPP) überwiegend trans-D-Bergamoten (74 %). Es handelt sich um die erste beschriebene trans-D-Bergamotensynthase. Mit geringer Effizienz katalysiert sie auch die Bildung von Monoterpenen aus GPP. Sie gehört phylo-genetisch zur Klasse TPS-b der Terpensynthasefamilie, in der nahezu nur Monoterpensynthasen eingeordnet sind. Sie stellt damit ein weiteres Beispiel einer Sesquiterpensynthase dar, die vermutlich aus einer Monoterpensynthase hervorging. Obwohl die drei Terpensynthasen nur für einen Teil der Terpene des etherischen Öls von Lavandula angustifolia verantwortlich sind, stellt die Kenntnis ihrer Gensequenzen eine Grundlage dar, mit der die gezielte genetische Modifizierung von Lavendelpflanzen und die Beeinflussung ihres Aromaprofils ermöglicht wird.
Im etherischen Öl von Lavandula angustifolia tragen auch die Ester von Terpenalkoholen und kurzkettigen Alkoholen, vor allem Linalylacetat, wesentlich zum Aroma bei. Da deren Biosynthese von Acyltransferasen der BAHD-Superfamilie katalysiert wird, wurden basierend auf dem gemeinsamen Aminosäuremotiv DFGWG die beiden Sequenzen LaAT1 und LaAT2 in Volllänge kloniert. Phylogenetisch ist LaAT1 verwandt mit der Acyltransferasen-Untergruppe V, die als Donorsubstrate Coenzym A-Ester von Hydroxyzimtsäuren und Benzoesäure benötigen und die Säurereste auf die Hydroxy- oder Aminofunktionen von Chinasäure und Shikimisäure sowie Anthranilsäure und deren Derivaten übertragen. LaAT2 enthält ebenfalls alle charakteristischen Sequenzelemente der BAHD-Acyltransferasen, weist aber insgesamt wenig Ähnlichkeit zu den bisher beschriebenen auf und könnte Mitglied einer neuen Untergruppe sein. LaAT1 und LaAT2 wurden heterolog in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae exprimiert und in einem Substratscreening mit unterschiedlichen Coenzym A-Estern und Alkoholen umgesetzt. Lediglich LaAT1 war in Enzymassays aktiv und katalysierte als erster Vertreter der BAHD-Superfamilie die Bildung sowohl von Amid- als auch Esterbindungen, die in Caffeoyl- und Cumaroylshikimat, Caffeoyl-und Cumaroyltyramin sowie Cumaroylanthranilat resultierte. Bisher wurde die Synthese der Tyraminderivate in Pflanzen ausschließlich der Familie der Tyramin-N-hydroxycinnamoyltransferasen zugeschrieben, die sich deutlich von den BAHD-Acyltransferasen unterscheiden. LaAT1 ist damit zwar nicht in die Aromabiosynthese involviert, könnte aber andere wichtige Funktionen im Sekundärmetabolismus übernehmen.
Description
Plants contain a huge number of secondary compounds like terpenoids, alkaloids and phenolic substances which are synthesized by numerous different enzymes. Three enzyme families were investigated in this study that play important roles in secondary metabolism: glucosyltransferases, terpene synthases and acyl-transferases.
Recently a UDP-glucose:cinnamate glucosyltransferase of the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa) (FaGT2) was characterized catalyzing the formation of cinnamic acid and p-coumaric acid glucose esters during strawberry fruit ripening. This enzyme, which is induced by ripening and oxidative stress, also transforms other, structurally diverse substrates of natural and anthropogenic origin in vitro. The kinetic parameters of these compounds were compared to elucidate additional biological functions of FaGT2. Accepted substrates ranged from derivatives of cinnamic acid and benzoic acid to heterocyclic and aliphatic compounds resulting in the formation of O- and S-glucose esters as well as O-glucosides. In planta assays confirmed the formation of glucose derivatives after injection of the substrates into strawberry fruits. Common chemical and structural features required for activity were the easy subtraction of a proton from the glucosylation site and the conjugation of the formed anion with S-electrons as best realized in the simplest substrate sorbic acid. In addition to cinnamic acid, the natural compounds anthranilic acid, (E)-2-hexenoic acid, nicotinic acid and 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone were glucosylated. The derived glucosidic products may serve as precursors for the formation of important flavor compounds or as storage forms in the strawberry. But FaGT2 was also capable of efficiently converting xenobiotic substances like the herbicide 2,4,5-trichlorophenol and the herbicide analogue 3,5-dichloro-4-hydroxybenzoic acid. The results suggest that FaGT2 is involved in the detoxification of xenobiotics in accordance to its induction by oxidative stress.
The monoterpene alcohol linalool contributes to the flavor of the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa) and occurs predominantly as (S)-enantiomer. The biosynthesis of (S)-linalool in strawberry fruit was recently elucidated and is catalyzed by the terpene synthase FaNES1. In the foliage of Fragaria x ananassa and especially of the wild stawberry (Fragaria vesca) a higher percentage of (R)-linalool in addition to (S)-linalool is present. A polymerase chain reaction (PCR) strategy based on the homology of terpene synthase genes was applied to complementary DNA (cDNA) from leaves of Fragaria x ananassa and Fragaria vesca resulting in the extraction of two partial sequences with high identity to FaNES1. The full length sequence from Fragaria x ananassa, FaLINS, was cloned, the encoded protein was expressed in Escherichia coli and assayed with geranyl diphosphate (GPP). Analysis with multidimensional gas chromatography mass spectrometry revealed that FaLINS exclusively synthesizes (S)-linalool like FaNES1, despite several sequence differences. Apparently the two sequences represent separate alleles or paralogous genes differentially expressed in leaves and flowers. In Fragaria vesca a linalool synthase (FvNES) with unknown stereospecificity was previously identified. Its sequence is also homologous to FaNES1, but it additionally carries an N-terminal signal peptide. The enzyme was heterologuosly expressed and assayed like FaLINS, showing the exclusive formation of (S)-linalool. Thus, it can be excluded that the N-terminal sequence part affects the stereospecificity of the enzymatic reaction.
The economically important essential oil of true lavender (Lavandula angustifolia) contains many mono- and sesquiterpenes. Similar to the experiments with strawberry a homology-based PCR strategy allowed cloning of three terpene synthase genes, LaLIMS, LaLINS and LaBERS. Phylogenetic analysis showed similarities to terpene synthases from other species of the family Lamiaceae. The enzymes were heterologously expressed in Echerichia coli and biochemically characterized determining optimum pH, temperature and cofactor concentrations as well as kinetic parameters. LaLIMS synthesizes the six monoterpenes limonene (39 %), terpinolene (22 %), camphene (16 %), D-pinene (14 %), E-myrcene (8 %) and D-phellandrene (1 %). Analysis with chiral phase gas chromatography showed high abundance of the enantiomers (1R,5R)-(+)-D-pinene, (1R,4S)-(+)-camphene and (R)-(+)-limonene. Supplying enzyme assays with manganese or magnesium cations caused different product patterns emphasizing the influence of these cofactors on structure and reactivity of terpene synthases. Multiple product synthases like LaLIMS give an explanation for the huge variety of terpenes in essential oils without the need for a high number of enzymes. LaLINS catalyzes the transformation of GPP exclusively to (R)-linalool. The abundant formation of the (R)-enantiomer corresponds to the configuration of the main components of lavender oil, (R)-linalool and (R)-linalyl acetate. Thus, LaLINS probably is highly important for the flavor profile of Lavandula angustifolia. The third enzyme, LaBERS, is a sesquiterpene synthase predominantly forming trans-D-bergamotene (74 %) from farnesyl diphosphate (FPP). It is the first trans-D-bergamotene synthase described. With low efficiency the enzyme also converts GPP to monoterpenes. Phylogenetically LaBERS belongs to class TPS-b of the terpene synthase family that comprises almost only monoterpene synthases. It is another example of a sesquiterpene synthase, which probably evolved from a monoterpene synthase. Although the three terpene synthases account for only a part of the essential oil constituents of Lavandula angustifolia, the knowledge of their sequences provides the basis for the specific genetic modification of lavender plants and their flavor profile._
The essential oil of Lavandula angustifolia also contains esters of terpene and short-chained alcohols, predominantly (R)-linalyl acetate, which notably contribute to the flavor. The biosynthesis of these substances is catalyzed by acyltransferases of the BAHD superfamily. Based on the common amino acid motif DFGWG the full length sequences of LaAT1 and LaAT2 were cloned. LaAT1 is phylogenetically related to acyltransferases of group V. These enzymes accept coenzyme A esters of hydroxy cinnamic acids and benzoic acid and transfer the acyl moieties to hydroxy and amino functions of quinic acid and shikimic acid as well as anthranilic acid and derivatives thereof. LaAT2 also contains all characteristic sequence elements of BAHD acyltransferases, but is poorly similar to the characterized enzymes of this family and could be member of a new group. LaAT1 and LaAT2 were heterologously expressed in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae and subjected to a substrate screening with different coenzyme A esters and alcohols. Activity was only detected for LaAT1, which catalyzed the formation of both amides and esters. This dual reactivity was never reported before for a member of the BAHD superfamily and resulted in the synthesis of caffeoylshikimate, caffeoyl- and coumaroyltyramine as well as coumaroylanthranilate. In plants tyramine derivatives are generally synthesized by enzymes of another family, the tyramine N-hydroxycinnamoyl-transferases clearly distinct from BAHD acyltransferases. Thus, LaAT1 seems not to be involved in the biosynthesis of flavor, but might have other important functions in secondary metabolism.
Stichwörter
Sekundärstoffwechsel, Lavendel, Erdbeere, Enzyme
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