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Bastadins and Related Compounds from the Marine Sponges Ianthella basta and Callyspongia sp:
Structure Elucidation and Biological Activities
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Autor(en):
Köln, 13. Juni 2008
Seiten: 252
Auflage: 1 Aufl.
Sprache: EN
ISBN-10: 3867276188
ISBN-13: 9783867276184
Zugeordnete Fachbereiche:
Pharmazie
Kategorie:
Dissertation
Bezugsmöglichkeiten
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Kurzbeschreibung
Schwämme sind fest sesshafte wirbellose Weichtiere, die auch über keine Schale
verfügen (Armstrong & Quigley 1999). Um sich vor Foulingorganismen, Angreifern und benachbarten Artgenossen, mit denen sie um Lebensraum konkurrieren, zu schützen, verfügen sie statt dessen über bioaktive Substanzen als Abwehr (Proksch u. a. 2002). In diesem Projekt wurde der Meeresschwamm Ianthella basta Oken, 1815, der zur Ordnung Verongida Bergquist, 1978, gehört, untersucht. In biochemischer Hinsicht charakteristisch für Lebewesen der Ordnung Verongida ist die Produktion von bromierten Thyrosinderivaten (Bergquist & Cook 2002). Verschiedene Bastadine und eine bromierte Phenylessigsäure wurden isoliert. Ein weiterer Schwamm, Callyspongia „blau“, wurde untersucht und es wurde ebenfalls einen bromierter Diphenyläther gewonnen (Compound 5). Bastadine sind charakteristische sekundäre Metaboliten des Schwammes I. basta. Es handelt sich bei diesen Substanzen um bromierte, von Tyrosin abgeleite, oximhaltige Makro-Bisdiaryl-Äthertetrapeptide, die entweder linear oder zyklisch sind. 36 Bastadin- und Hemibastadinderivate sind bekannt. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Verwandter, benannt „Bastadin-24“, isoliert. Bastadine hemmen nicht nur die Ansiedlung von Seepocken-Larven, Thrombozyten-aggregation, Bakterienvermehrung/-wachstum, Proteinkinasen und wirken zytotoxisch (wie in dieser Arbeit gezeigt), sondern sie zeigen beispielsweise auch antagonistische Effekte auf Ryanodin-Rezeptoren und Kalziumkanäle im endoplasmatischen Reticulum (Mack u.a. 1994, Chen u.a.1999). In diesem Projekt wurden zehn Bastadine (Bastadine -2, -3, -4, -6, -7, -9, -10, -11, -16, -24), ein Hemibastadin (Hemibastadin-1), eine Phenylessigsäure und ein bromierter Diphenyläther isoliert und strukturell aufgeklärt. Außerdem wurden drei Hemibastadin-1-Verwandte (L-Tyrosin-Tyramid, Norbromo-Hemibastadin-1 und 6,6’- Dibromo-Hemibastadin-1) für SAR-Untersuchungen isoliert. Alle Verbindungen (isolierte und synthetisierte) wurden in folgenden Assays getestet: i.) Seepocken-Antifouling-Assay, ii.) humane Thromboyzten–Aggregation, iii.) Zytotoxizität, iv.) antibiotische Aktivität und v.) Hemmung von verschiedenen Proteinkinasen. Biologisches „Fouling“ führt weltweit zu erheblichem wirtschaftlichen Verlust und zusätzlicher Umweltbelastung durch die Verringerung der Geschwindigkeit von Schiffen und die Steigerung des Kraftstoffverbrauches (Wahl 1989). Bisher wurden zur Vermeidung biologischer Beschmutzungen Organotin, Kupferoxid und Herbizide benutzt. Derartige Bekämpfungsmittel wurden allerdings zwischenzeitlich von der IMO geächtet und sind ab 2008 verboten (IMO 2001). Seepocken sind in dieser Hinsicht sehr schädliche Makrofoulorganismen. Es wird derzeit versucht, die Physiologie von Seepocken-Larven, deren Ansammlungsverhalten und deren Fähigkeit zur Metamorphose zu erforschen (Fusetani 2004, Sjögren u. a. 2004, Dahlstrom u. a. 2005). Das ist nicht nur für die Durchleuchtung des ökologischen Prozesses, sondern auch dafür wichtig, umweltfreundliche Pestizide zu finden. Da Schwämme Filterfresser sind, wäre für sie eine Überwachsung mit Faulorganismen fatal, weil hierdurch ihre Atemporen verstopft würden. Ein chemischer Schutz ist daher für das Überleben dieser Organismen absolut überlebensnotwendig. Aus diesem Grund sind sie sehr interessante Forschungsobjekte auf der Suche nach Antifouling-Substanzen. Die Bastadine, die im Rahmen dieser Untersuchung isoliert wurden, wurden in einem Seepocken-Antifouling-Assay zusammen mit synthetisierten Hemibastadin-Analogen und anderen bromierten Verbindungen, die zuvor isoliert wurden, untersucht. Alle Bastadine, Hemibastadin-1, Norbromohemibastadin-1, 2,2’-Dibromo-hemibastadin-1 und Psammaplin A erwiesen sich im Rahmen dessen als wirksam gegen die Ansiedlung von Zypriden. Bastadin-16, Hemibastadin-1, Norbromohemibastadin-1 und Psammaplin A zeigten toxische Wirkung gegen die Seepocken-Larven. Es wurde daraus der Schluss gezogen, dass eine Oxim-Gruppe wesentlich für die Antifouling- Aktivität dieser Verbindungen ist. Im Gegensatz zum lipophilen Psammaplin A, zeigte
das hydrophole sulfierte Psammaplin A-Derivat keine Antifouling-Aktivität. Es wurde daher vermutet, dass die Verbindung die Zellmembranen durchdringt und ihren Effekt an intrazellularen Rezeptoren ausübt. Der bromierte Diphenyläther (Compound 5) war im Seepocken-Antifouling-Assay aktiv, ohne toxischen Wirkung zu haben. Diese Verbindung wurde zusammen mit anderen Diphenyläthern mit hilfe einer Screening-Untersuchung auf die Wirksamkeit
gegen Bakterienwachstum, Diatome Aktivität und gegen Molluskenansiedlung
untersucht. Compound 5 erwies sich in sämtlichen der drei Assays als die Aktivste. Die anderen aktiven bromierten Diphenyläther trugen - ebenso wie Compound 5 - sämtlich vier Bromelemente. Der nicht bromierte Diphenyläther zeigte keinerlei Aktivität. Da bekannt ist, dass oximhaltige Verbindungen thrombozytenaggregations-hemmende Eigenschaften haben, wurden die Bastadine auf die Hemmung von menschlichen Thrombozytaggregation getested. Dies führte zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bastadin-9 und -16 zeigten die ausgeprägteste Aktivität gefolgt von Norbromohemibastadin-1 und Bastadin -6 und -7. Keine der untersuchten Verbindungen hemmte Thromboxanbildung in einem nennenswerten Maß. LTyrosintyramide zeigten keinerlei Aktivität und die Aktivität der anderen Hemibastadin-1-Analogen ging mit wachsendem Bromanteil zurück. Bastadin-16 und Norbromohemibastadin-1 wurden dann im Hinblick auf ihren Wirkmechanismus untersucht und ferner auf ihre Hemmung der durch kollagen-, ADP, Kollagen + SC 560 (COX-1 Antagonist) sowie mit dem Thromboserezeptor (TP) Agonist U 46619 stimulierte Thrombozytaggregation, getestet. Die Ergebnisse deuten auf eine TPantagonistsiche Wirkung. Bastadin-16 und Norbromohemibastadin-1 sowie die inaktiven Bastadine 3 und 11 wurde in einem TP-Displacement-Assay getestet. Interessanterweise erwiesen sich sämtliche getesteten Verbindungen dort als aktiv gegen TP. Wieso Bastadin-3 und -11 hier aktive waren muß noch weiter aufgeklärt werden, aber die Bindung an Plasmaproteine mag eine Erklärung hierfür sein. Alle Verbindung wurden auf ihre zytotoxische Wirkung gegen das Mäuselymphom L5178Y getestet. Von den Bastadinen waren Bastadin-2, -4, -11, und -16 aktiv. Compound 5 war die aktivste Verbindung und bemerkenswerter Weise war das Hemibastadin-1 Analog L-Tyrosintyramid das einzig aktive synthetisierte Derivat. Es
war in keinem anderen Assay aktiv. Es ist schwierig, hieraus irgendwelche SARSchlüsse für die Zytotoxititäts-Daten zu ziehen, aber offensichtlich spielt die
Bromhaltigkeit keine größere Rolle. Die Verbindungen, die auf die Hemmung von Proteinkinasen getestet wurden, waren die Bastadine – 3, -6, -7, -11, -16 und – 24 sowie alle synthetisierten Hemibastadin-1 Analogen. Bastadin-3 zeigte die stärkste Hemmungswirkung gegen Proteinkinasen gefolgt von Bastadin-24. Die am wenigsten aktiven Bastadine waren Bastadin -6 und - 16, die nur wenige Proteinkinasen hemmten. Bastadin-7 zeigte eine breitere Hemmugswirkung als die Bastadine -6 und -16, jedoch nicht so stark wie Bastadin – 3 und -24. Keiner der synthetisierten Hemibastadin-1 Analogen war aktiv. Eine lineare Struktur scheint eine hemmende Wirkung gegen Proteinkinase zu begünstigen.
Keine der Verbindungen, die im Rahmen dieses Projekts isoliert oder synthetisiert wurden, zeigte irgendwelche Aktivität gegen die Biofilmbildung durch S. Epidermidis. Die Bastadine Bastadin-3 und -4 ebenso wie Hemibastadin-1 und Verbindung 5 zeigten indes Aktivität gegen verschiedene Bakterienstämme wie beispielsweise S. Epidermidis, S. Aureus und E. faecium. Aktivität gegen L. major und T. brucei wurde bei Compound 5 beobachtet. Bastadin-4 erwies sich ebenfalls als aktiv gegen T. brucei. Wie zu Beginn dieser Arbeit dargelegt, verfügen aus Meeresschwämmen gewonnene Metaboliten über eine große Bandbreite biologischer Aktivitäten. Dies hat seinen Grund wahrscheinlich in der ihnen in der natürlichen Umgebung zukommenden Abwehrfunktion. Diese Abwehrfunktion und -wirkung tritt mit der Antifouling- Aktivität der untersuchten Bastadine ebenfalls zutage. Die Entdeckung dieser bislang unbekannten aktiven Eigenschaften (Antifouling und Hemmung von Thrombozyten- Aggregation) der hier untersuchten Bastadine dürfte zum Verständnis der Funktionsweise dieser Lebewesen ebenso beitragen wie zum Verständnis von biologischen und pharmakologischen Systemen überhaupt.
Description
Sponges are soft bodied and sessile animals, which lack spine and shell (Armstrong & Quigley 1999). For their defence against fouling organisms, predators, and neighbours competing for space, sponges rely on bioactive natural products instead (Proksch et al. 2002). In this project the marine sponge Ianthella basta Oken, 1815, belonging to the order Verongida Bergquist, 1978, was investigated. Species of the order Verongida are biochemically characterised by the production of brominated tyrosine derivatives. (Bergquist & Cook 2002) Several bastadins and a brominated phenyl acetic acid were
isolated. One other sponge was investigated too, Callyspongia “blue”, which yielded a brominated diphenyl ether (compound 5). Bastadins are characteristic secondary metabolites of the sponge I. basta. They are tyrosine-derived, brominated, oxime-bearing macro bis-diaryl ether tetrapeptides, which can be either cyclic or linear. 36 bastadin and hemibastadin derivatives are
known; additional to these one new congener named bastadin-24 was isolated during this work. The bastadins do not only inhibit barnacle larval settlement, thrombocyte aggregation, display cytotxicity, inhibit bacterial growth as well as protein kinases, as described in this thesis, but do also show for example antagonistic effects on the ryanodin receptor and calcium channels in the endoplasmatic reticulum (Mack et al. 1994, Chen et al. 1999)
In this project ten bastadins (bastadin-2, -3, -4, -6, -7, -9, -10, -11, -16, -24), one
hemibastadin (hemibastadin-1), one phenyl acetic acid and one brominated diphenyl ether were isolated and elucidated. In addition to these three hemibastadin-1 congeners, were synthesized (L-tyrosine-tyramide, norbromohemibastadin-1 and 6,6’- dibromohemibastadin-1) for SAR studies.
All compounds (isolated and synthesized) were tested in following assays: i) barnacle antifouling assay, ii) human thrombocyte aggregation, iii) cytotoxicity, iv) antibiotic activity, and v) inhibition of different protein kinases.
Biofouling causes significant economical and environmental losses worldwide through reducing boat speeds and increasing fuel consumption (Wahl 1989). Until today organotin, copper oxide, and herbicide coatings have been commercially used for preventing on-growth. These coatings were, however recently banned IMO with a complete prohibition by 2008 (IMO 2001). Barnacles are severe macro-fouling organisms. Attempts are now being made to understand the physiology of barnacle larvae, their settlement behaviour, and their ability to metamorphose (Fusetani 2004, Sjögren et al. 2004a, Dahlström et al. 2005).
This is important not only for understanding ecological processes,
but also for finding environmentally sound non-toxic antifouling agents.
As sponges are filter feeders, over-growth by fouling organisms would be devastating for their survival as inhaling pores would likely be clogged. A reliable chemical defence is therefore decisive for these organisms. And they therefore have become prime candidates in the search for antifouling entities.
The bastadins isolated here were screened in the barnacle assay together with the synthesized hemibastadin analogues as well as other previously isolated brominated compounds of sponge origin. All bastadins, hemibastadin-1, norbromohemibastadin-1, 2,2’-dibromo-hemibastandin-1, and psammaplin A, turned out to be active against barnacle cyprid settlement. Bastadin-16, psammaplin A, hemibastadin-1, and norbromohemibastadin-1 also showed to be toxic against the larvae. The conclusion was drawn that an oxime group is decisive for the antifouling activity in these compounds. In contrast to the lipophilic psammaplin A, the hydrophilic sulphated psammaplin A derivative showed no antifouling activity. It was therefore hypothesized that the compound needed to cross membranes and that the target for psammaplin A lied intracellularly. The brominated diphenyl ether (also called compound 5) was active without any toxicity in the barnacle antifouling assay. This compound was taken into screening studies together with other diphenyl ethers against bacterial growth, diatom activity, and mollusc settlement. Compound 5 turned out to be the most active substance in all of the three assays. The other active brominated diphenyl ethers did all carry four bromines, just like compound 5. The non-brominated diphenyl ether did not display any activity at all.
The knowledge that oxime bearing compounds possess thrombocyte anti-aggreagtion properties took the bastadins to be tested against human thrombocyte aggreagation with various results. Bastadin-9 and -16 showed the most pronounced activites followed by norbromohemibastadin-1 as well as bastadin-6 and -7. Neither of these inhibited the thromboxane formation to an effeicient extent. L-tyrosine-tyramide did not show any activity and the activity of the other hemibastadin-1 analogues decreased with increasing amounts of bromines. Bastadin-16 and norbromohemibastadin-1 were taken further to studies of the mechanism of action and tested against thrombocyte aggregation stimulated with collagen, ADP, collagen+SC 560 (COX-1 antagonist), and the thromboxane receptor (TP) agonist U 46619. The results pointed in the direction of a TP antagonistic effect. Bastadin-16 and norbromohemibastadin-1 as well
as the inactive bastadins 3 and 11 were tested in a TP displacement assay. Interestingly all the tested compounds turned out to be active against TP. Further tests remain to be done to evaluate why some bastadin-3 and -11 do not inhibit the aggregation but indeed TP. Binding to the plasma proteins may be a reason for this observation. All compounds were tested for their cytotoxicity against the mouse lymphoma, L5178Y. Active bastadins were bastadin-2, -4, -6, -11, and -16. Compound 5 was the most active substance and interestingly the hemibastadin-1 analogue L-tyrosinetyramide, was the only synthezised derivative displaying activity. This compound was not active in any other assays. It is difficult to draw any SAR conclusions to the cytotoxicity data, but obviously the bromination does not play a major role. The compounds tested for their protein kinase inhibition were bastadin-3, -6, -7, -11, -16, and -24 as well as the full set of synthesized hemibastadin-1 analogues. Bastadin-3 exhibited the strongest inhibition against most protein kinases followed by bastadin-24. The least active bastadins turned out to be bastadin-6 and -16, which only inhibited
a few protein kinases. Bastadin-7 showed a broader inhibitory effect than these, but not as strong as bastadin-3 and bastadin-24. None of the successfully synthesized hemibastadin-1 analogues were active. A linear structure seems to advocate a protein kinase inhibition. None of the compounds isolated or synthesized in this project showed any activity against S.epidermidis biofilm formation. However, activity against several bacterial stains including S. epidermidis, S. aureus, and E. faecium was shown by bastadin-3
and -4 as well as hemibastadin-1 and compound 5. Activity against L. major and T. brucei was observed for compound 5. Bastadin-4 was also active against T. brucei. As stated in the beginning of this thesis, sponge-derived metabolites possess a great vary of biological activities. This is probably because of their defensive function in their original environment. This defence mechanism can also be seen by the antifouling activity displayed by the bastadins. The novel bastadin activities found here may contribute to the understanding of the mode of action of these entities as well as increase the comprehension of the biological and pharmacological systems as such.
Keywords
Bastadin, Ianthella basta, Thrombocyte aggregation, Antifouling.
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